Protocol de PCR
 |
Aquesta pàgina necessita alguna millora en el contingut o l'estil. Potser a la pàgina de discussió trobareu més informació sobre les seves mancances. |
PROTOCOL DE PREPRACIÓ D’UN GEL D’AGAROSA PER PCR
1) En primer lloc tenir en compte les característiques del gel que es vol preparar segons el número de mostres que recollirem de la PCR.
2) Agafar guants i recollir les mostres.
3) Una vegada tenim establertes les característiques del gel (concentració d’agarosa, quantitat de TAE, quantitat de Loading Buffer, etc) agafarem la cubeta i les pintes (les petites tenen una capacitat de 50ml i les mitjanes de 100ml). (tot aquest procediment requereix guants degut a les restes de Bromur d’etidi).
4 Separar les pintes de la base de la cubeta per uns 2mm aproximadament. Recobrir els espais de la cubeta amb cinta d’autoclau per evitar perdre l’agarosa quan encara sigui liquida.
5) Agafar el TAE Buffer 1x o el TBE Buffer 1x, 50ml per cubetes petites i 100ml per les mitjanes. La composició de 1 litre de TAE Buffer 50x és de: 242g Tris base (2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol); 57,1ml D’àcid acetic; 100ml d’EDTA al 0.5M a pH 8.0; i H2O.
6) Una vegada tenim el buffer a l’erlenmeyer agafarem l’agarosa i pesarem la quantitat. Si utilitzem Agarosa al 1,5% hem de pesar 1,5g per 100ml de TAE o 0,75g per 50ml de buffer. L’agarosa 1,5% ha de bullir dintre de l’erlenmeyer juntament amb el TAE durant uns minuts (fins que desapareguin els cristalls que observem a contra llum). Proporció % d’Agarosa 100ml TAE ---- 1.5% ---- 1,5gr 50ml TAE ---- 1,5% ---- 0.75gr
7) Amb l’erlenmeyer dintre de la campana de gasos abocarem 13l de Bromur d’etidi amb les pipetes no marcades. El Bromur d’Etidi està a una concentració de treball de 1mg/mL. Per gels de 50ml posem 1.3mg i per gels de 100mL posem 3mg. Aquest procediment s’ha de fer amb molta cura, ja que el Bromur d’etidi (utilitzat com a marcador d’àcids nucleics a la llum UV) és un mutagen potent, irritant las ulls, pell i mucoses.
8) Una vegada l’erlenmeyer s’ha refredat omplirem la cubeta amb el seu contingut i deixarem refredar durant uns 25’ aproximadament (fins que solidifiqui el gel).
9) Durant els 25’ minuts de solidificació del gel prepararem les mostres. En primer lloc farem un spin als tubs de la PCR. Els productes de PCR s’han de carregar al gel d’agarosa barrejades amb el Loading Buffer 10X, que augmenta la viscositat de la mostra i permet que entri completament al fons del pou. A més dona coloració al gel per seguir en tot moment la migració dels fragments. En funció del volum que carreguem de mostra, posarem la quantitat de loading buffer que correspongui. Per exemple, posarem 1l de per 10microl de mostra. En alguns casos utilitzarem H2O miliQ juntament amb la mostra, en aquest cas hem de tenir en compte el volum total de mostra i de H2O per afegir el LB. Aquests Loading Buffer està compost per bromophenol blue (0,25%) i xylene cyanol (0,25%) que ens permeten observar les migracions del DNA. Proporció de Loading Buffer 1L LB ---- 10L Mostra
10) Fer spin a les mostres ja preparades.
11) Introduir el gel a la cubeta d’electroforesis i observar el nivell de TAE. Separar les pintes del gel fent pressió amb els dits.
12) En el primer pou de cada fila introduirem 4microl de Lader. Si tenim dues files hem d’introduir Lader als dos primers pous. El Lader Buffer és l’escala composta per un nombre conegut de parells de bases de DNA, auquesta banda de referéncia s’utilitza per l’observació de la migració dels parells de bases obtingudes de la PCR i introduïdes als pous.
13) Una vegada tinguem la cubeta conectada a uns 80/100 V esperarem uns 30’ aproximadament.
14) Quan puguem observar la migració del LB ja tindrem una guia per a l’observació amb llum UV.